Evaluación de métodos de diagnóstico serológico y molecular en caninos naturalmente expuestos a Ehrlichia canis de áreas endémicas del centro de Colombia

Abstract

La bacteria E. canis es considerada el agente causal de la Ehrlichiosis Monocítica Canina, que circula entre las áreas tropicales y subtropicales del mundo. Así mismo, el diagnostico en los animales infectados depende de la variación genética y antigénica que presentan estas bacterias. El cual, puede generar resultados variables dependiendo de los antígenos o regiones genéticas amplificadas. Por consiguiente, el presente estudio evaluó distintos métodos de diagnóstico para identificar caninos infectados con E. canis. Se realizó un muestreo no probabilístico por conveniencia siguiendo criterios de inclusión y exclusión donde se seleccionaron 248 caninos de 10 zonas del centro del país. De estos caninos, se tomaron muestras de sangre de la vena cefálica con la finalidad de obtener, plasma, suero y ADN. El diagnostico serológico se realizó mediante la ELISA indirecta empleando como antígenos péptidos sintéticos derivados de la proteína TRP36. El DNA se extrajo de las muestras de sangre y plasma para realizar las PCR en tiempo real con sondas dirigidas las regiones codificantes para los genes 16S rRNA, DSB y TRP-36. Mediante la prueba de ELISA indirecta se identificó una seropositividad de 61.3% 152/248); con la PCR en tiempo real empleando el gen 16S rRNA se identificó una positivad de 46,0 % (114/248), amplificando el gen DSB fue de 19,80% (49/248) y con el gen TRP-36 fue de 11,30% 28/248 animales sintomáticos fueron 41.54% (103/248) y asintomáticos 58.46% (145/248; de los cuales 11.30% (28/248) eran polisintomáticos y 88.70% (220/248) eran oligosintomáticos. Los signos con mayor presentación clínica (p≤ 0,05) fueron, mucosas pálidas 53 (21.37%), ganglios aumentados de tamaño 42 (16.93%), queratoconjuntivitis 36 (14.51%), depresión 31 (12.5%), secreción ocular 23 (9.27%), pérdida de peso 20 (8.06%), debilidad 17 (6.85%), petequias 16 (6.45%), arritmia cardiaca 11 (4.43%), anorexia 10 (4.03%), fiebre 10 (4.03%), equimosis 3 (1.20%), hematuria 3 (1.20%), ataxia 2 (0.80%), edema miembros posteriores 2 (0.80%), epistaxis 2 (0.80%), hipema 2 (0.80%), cianosis 1 (0.40%), disnea 1 (0.40%), hemorragia retina (0,40%) y presencia de garrapatas 125 ( 50.4% ) de 248 pacientes. En el índice Kappa, hubo una alta concordancia entre el diagnostico de PCR por las diferentes sondas (genes 16Sr RNA, DSB y TRP 36) pero baja frente a ELISA. El análisis de asociación mostró que la prueba de ELISA no presentaba correlación con animales sintomáticos y asintomáticos. El diagnostico por RT-PCR con el gen 16S rRNA sólo presentó asociación con a la presencia de garrapatas (p<0,007) y arritmia cardiaca (p<0,005), siendo que la presencia de garrapatas se identificó como factor de riesgo para este diagnóstico (O. R=1,997). No obstante, el diagnóstico molecular con el gen DSB presentó asociación con la equimosis (p<0,04), depresión (p<0,01), sintomáticos (p<0,002) y asintomáticos (p<0,002), siendo que la equimosis (O. R= 8.426), depresión (O. R=2,591) y animales sintomáticos (O. R=2,725) fueron factores de riesgo para el diagnóstico positivo mediante esta sonda. Igualmente, los animales diagnosticados mediante la amplificación del gen TRP-36 estuvieron asociados con animales sintomáticos (p<0,02) y asintomáticos (p<0,02), siendo que la presencia de síntomas (O. R=2,408) se identificó como factor de riesgo para este diagnóstico. Lo anterior sugiere que la ELISA fundamentada en péptidos derivados de gp36 puede identificar animales en la fase activa como en la fase pasiva de la EMC, mientras que la PCR con 16S puede identificar animales infectados con Anaplasmataceae en la fase de transmisión activa. Por otro lado, las PCR por DSB y TRP36 mostraron mayor posibilidad de diagnóstico de animales en la fase activa considerando los factores de riesgo identificados. Lo anterior demuestra que la ELISA fundamentada en antígenos provenientes de las regiones conservadas de gp36 pueden ser una opción viable para el diagnóstico en cualquier fase de la EMC, mientras que el diagnostico por PCR con las sondas 16S rRNA, DSB y TRP-36 está relacionado con la fase activa debido a la mayor carga bacteriana y la infecciosidad que presentan los animales en esta fase.

The E. canis bacterium is considered the causal agent of Canine Monocytic Ehrlichiosis, which circulates between tropical and subtropical areas of the world. Likewise, the diagnosis in infected animals depends on the genetic and antigenic variation that these bacteria present. Which can generate variable results depending on the antigens or genetic regions amplified. Therefore, the present study evaluated different diagnostic methods to identify canines infected with E. canis. For this, a non-probabilistic convenience sampling was carried out following inclusion and exclusion criteria. 248 canines were selected from 10 areas in the center of the country. From these canines, blood samples were taken from the cephalic vein to obtain plasma, serum, and DNA. The serological diagnosis was made by indirect ELISA using synthetic peptides derived from the TRP-36 protein as antigens. DNA was extracted from blood and plasma samples to perform real-time PCR with probes directed at amplifying the coding regions for the 16S rRNA, DSB, and TRP-36 genes. Using the indirect ELISA test, a seropositivity of 61.3% (152/248) was identified; with real-time PCR using the 16S rRNA gene, a positive rate of 46.0% (114/248) was identified, amplifying the DSB gene was 19.80% (49/248) and with the TRP-36 gene it was 11 .30% (28/248). Symptomatic animals were 41.54% (103/248) and asymptomatic 58.46% (145/248), of which 11.30% (28/248) were polysymptomatic and 88.70% (220/248) were oligosymptomatic. The signs with the greatest clinical presentation (p≤ 0.05) were pale mucous membranes 53 (21.37%), enlarged lymph nodes 42 (16.93%), keratoconjunctivitis 36 (14.51%), depression 31 (12.5%), ocular secretion 23 (9.27%), weight loss 20 (8.06%), weakness 17 (6.85%), petechiae 16 (6.45%), cardiac arrhythmia 11 (4.43%), anorexia 10 (4.03%), fever 10 (4.03%), ecchymosis 3 (1.20%), hematuria 3 (1.20%), ataxia 2 (0.80%), hind limb edema 2 (0.80%), epistaxis 2 (0.80%), hyphema 2 (0.80%), cyanosis 1 (0.40%) , dyspnea 1 (0.40%), retinal hemorrhage (0.40%) and presence of ticks 125 (50.4%) of 248 patients. The concordance using the Kappa index show a high concordance between the diagnosis of RT-PCR by the different primers (16Sr RNA, DSB and TRP 36) but low compared to the diagnosis with ELISA. The association analysis showed that the ELISA test did not present a correlation with symptomatic and asymptomatic animals. The diagnosis by RT-PCR with the 16S gene only presented an association with the presence of ticks (p<0.007) and cardiac arrhythmia (p<0.005), and the presence of ticks was identified as a risk factor for this diagnosis (O R=1.997). However, the molecular diagnosis with the DSB gene was associated with ecchymosis (p<0.04), depression (p<0.01), symptomatic (p<0.002) and asymptomatic animals (p<0.002), with the ecchymosis (OR= 8.426), depression (OR=2.591) and symptomatic animals (OR=2.725) were risk factors for positive diagnosis using this probe. Likewise, the animals diagnosed through the amplification of the TRP-36 gene were associated with symptomatic (p<0.02) and asymptomatic (p<0.02) animals, and the presence of symptoms (OR=2.408) was identified as a risk factor for this diagnosis. This suggests that ELISA based on gp36-derived peptides can identify animals in the active phase as well as in the passive phase of EMC, while 16S rRNA-PCR can identify animals infected with Anaplasmataceae in the active transmission phase. On the other hand, PCR by DSB and TRP36 showed a greater possibility of diagnosing animals in the active phase considering the identified risk factors. This demonstrates that ELISA based on antigens from conserved regions of gp36 can be a viable option for diagnosis at any stage of CME, while diagnosis by PCR with 16S rRNA, DSB and TRP-36 probes is related to the active phase due to the higher bacterial load and the infectivity that the animals present in this phase.