Sistemas alternativos para el control del ph del medio de cultivo durante la maduración in vitro de los complejos cúmulus-ovocitos bovinos

Abstract

Este estudio tuvo como objetivo evaluar dos métodos para controlar el pH del medio de cultivo durante la maduración in vitro (MIV) de ovocitos bovinos. Los complejos cúmulus-ovocitarios (CCOs) se obtuvieron de ovarios post mortem, se distribuyeron aleatoriamente en grupos de 20 CCOs y se cultivaron en medio de maduración durante 24h. Los grupos experimentales fueron: (i) sistema de gasificación química (ChR-Group) n = 787, que se basó en la adición de una pastilla efervescente, compuesta por 0.011g de ácido cítrico y 0.021g de bicarbonato de sodio en un tubo con agua conectado a un segundo tubo que contiene el medio de maduración; (ii) un medio de cultivo a base de 20 mM de TCM-HEPES (TCM-HEPES) n = 1147, independiente de una atmósfera controlada de CO2; y (iii) como grupo control (CNT- Group) n = 970, se utilizó un sistema de incubación convencional con 7% de CO2, 38.5°C y humedad saturada. Para los grupos ChR y TCM-HEPES, la maduración in vitro (MIV) se realizó en una incubadora portátil para ovocitos a 38.5°C. Después de la MIV, los CCOs de todos los grupos se fertilizaron in vitro (FIV) durante 18h, y los presuntos cigotos se cultivaron in vitro (CIV) durante 7 días en un medio SOFaaBSA. El procedimiento de FIV y CIV se realizó en una incubadora convencional. Evaluamos las tasas de maduración nuclear de los ovocitos, la tasa de clivaje y la producción de blastocistos. Además, se evaluó la expresión relativa del ARNm de los genes BAX, BMP15, AREG y EREG en ovocitos y células del cúmulus. Encontramos que el porcentaje de ovocitos que alcanzaron la metafase II fue similar entre los grupos CNT (n = 100) y ChR (n = 100) (77.57 y 77.06% respectivamente), pero menor (P<0.05) en el TCM-HEPES (n = 100) (65.32%). La producción de blastocistos también fue similar entre los grupos CNT (n = 603) y ChR (n = 418) (26.20 y 28.47%, respectivamente) y menor (P<0.05) en el TCM-HEPES (n = 743) (18.71%). La expresión relativa del ARNm del gen BAX en las células del cúmulus fue significativamente mayor (P<0.05) en el TCM-HEPES (n = 180) (3.30±0.51) en comparación con el grupo CNT (n = 160) (1.00±0.55). Además, la expresión relativa de ARNm del gen BMP15 fue menor (P=0.03) en ovocitos cultivados en TCM-HEPES (n = 180) (0.27±0.19) en comparación con el grupo CNT (n = 160) (1.00±0.18). En conclusión, el uso de un medio de maduración que no dependa de una atmósfera controlada de CO2 tiene efectos deletéreos sobre la maduración de los ovocitos y la producción de embriones. Sin embargo, el uso de la gasificación química puede ser una alternativa eficiente para mitigar este daño

This study aimed to evaluate two methods to control the pH of culture medium during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. The cumulus-oocytes complexes (COCs) were obtained from post mortem ovaries, distributed randomly in groups of 20 COCs and cultured in maturation medium for 24h. The experimental groups were: (i) chemical reaction (ChR-Group) system (n = 787), which was based on the addition of an effervescent tablet, composed of 0.011g of citric acid and 0.021g of sodium bicarbonate in a tube with water connected to a second tube containing the maturation medium; (ii) a culture medium based on 20mM of TCM-HEPES (TCM-HEPES) (n = 1147), independent of a controlled atmosphere of CO2; and (iii) as a control group (CNT-Group) (n = 970), a conventional incubator system was used with 7% of CO2, 38.5°C and saturated humidity. For groups ChR and TCM-HEPES, the in vitro maturation (IVM) was performed in a portable incubator for oocytes at 38.5°C. After IVM, the COCs from all groups were in vitro fertilized (IVF) for 18h, and the presumptive zygotes were in vitro cultivated (IVC) for 7 days in a SOFaaBSA medium. The IVF and IVC procedure were performed in a conventional incubator. We evaluated oocyte nuclear maturation rates, cleavage rate, and blastocyst production. Also, the relative mRNA expression of BAX, BMP15, AREG and EREG genes was evaluated in oocytes and cumulus cells. We found that the percentage of oocytes that reached the metaphase II was similar between CNT (n = 100) and ChR groups (n = 100) (77.57 and 77.06% respectively), but lower (P<0.05) in the TCM-HEPES (n = 100) (65.32%). The blastocysts production was also similar between CNT (n = 603) and ChR groups (n = 418) (26.20 and 28.47%, respectively) and lower (P<0,05) in the TCM-HEPES (n = 743) (18,71%). The relative mRNA expression of BAX gene in cumulus cells was significantly higher (P<0,05) in the TCM-HEPES (n = 180) (3.30±0,51) compared to the CNT-Group (n = 160) (1.00±0.55). Additionally, the relative mRNA expression of BMP15 gene was lower (P=0.03) in oocytes cultured in TCM-HEPES (n = 180) (0.27±0.19) compared to CNT Group (n = 160) (1.00±0.18). In conclusion, the use a maturation medium that does not depend on a controlled atmosphere of CO2 has deleterious effects on oocyte maturation and embryo production. However, the use of chemical gasification can be an efficient alternative to mitigate this damage.