Análisis transcriptomico de larvas Rhipicephalus sanguineus sensu lato provenientes del norte, occidente y oriente de la República de Colombia - modalidad Investigación

Abstract

Las garrapatas pertenecientes al complejo de Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l) incluye especies distribuidas a nivel mundial consideradas vectores de agentes importantes que afectan a los seres humanos y animales. Entre sus características ecológicas, estas especies de garrapatas presentan una gran capacidad de dispersión, lo que lleva a una mayor densidad de población. Pocos estudios se centran en identificar la expresión génica en relación con las condiciones ecológicas y los estadios de desarrollo. Por consiguiente, este estudio busco realizar perfiles de expresion transcriptomico de garrapatas de cuatro regiones ecológicas de Colombia. Para establecer las colonias en el laboratorio se recolectaron teleóginas de perros infestados que se ubicaban en las diferentes regiones. Posteriormente, las larvas colonizantes (QL) (Questing larvae) y las larvas ingurgitadas (LE) desprendidas de conejos desafiados se colectaron y conservaron a -80°C. De estos ejemplares se extrajo el ARN total que se cuantifico con Qubit y analizó LabChip. El perfil de expresión génica de los estadios se realizó empleando el ARN extraído para secuenciar la porción del extremo 3' del ARNm mediante MACE-seq (Massive Analysis of cDNA Ends), en la plataforma NextSeq empleando el kit Rapid MACE-Seq (GenXPro GmbH, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Así, se produjeron ocho bibliotecas de transcriptoma de las cuales se eliminaron las regiones duplicadas de PCR y los datos sin procesar. Las lecturas restantes se recortaron con poli (A) y se descartaron las lecturas de baja calidad. Las lecturas limpias se alinearon con el genoma de R. sanguineus (ASM1333969v1), se anotaron y se predijeron las proteínas generando los hits de expresión. Las bibliotecas se normalizaron y compararon entre QL y EL por cada región utilizando DEseq2. El análisis de expresión diferencial con un padj <0,05 evidencio 233 transcriptos significativos. El Blastp contra proteínas no redundantes mostró la anotación de proteínas que estaban involucradas en la función mitocondrial, obtención de energía en forma de ATP, degradación de carbohidratos y función ribosomal. Se identificaron términos GO asociados con la transcripción y traducción a proteínas, procesos asociados al metabolismo del nitrógeno y biosíntesis celular. Este enfoque revela un nuevo grupo de transcritos que se expresan en los estadios QL y EL de diferentes regiones ecológicas de Colombia.

The ticks belonging to the complex of R. sanguineus s.l group includes species distributed worldwide considered important agents for vector-borne diseases in humans and animals. Among its ecological characteristics, these tick species present a great dispersion capacity due to their elevated activity, leading to a higher population density. Fewer studies are focused on identifying gene expressions concerning ecological conditions and the instars of development. In our study, engorged females were collected from infested dogs belonging to four different ecological regions in Colombia to establish a laboratory colony. Newly questing larvae (QL) after hatching, and engorged larvae (EL) dropped from susceptible rabbits after the challenge were collected and conserved at -80°C. At each instar of the ticks, total RNA was extracted, and measured using Qubit and LabChip. Genome-wide gene expression profiling was performed using MACE-seq with RNA extracted from each tick instars to sequencing the 3’ end portion of the mRNA. Eight transcriptome libraries were produced using the Rapid MACE-Seq kit (GenXPro GmbH, Germany), following the manufacturer’s protocol using a NextSeq platform. PCR-duplicates were identified and removed from the raw data. The remaining reads were further poly (A)-trimmed, and low-quality reads were discarded. The clean reads were aligned to the R. sanguineus genome (ASM1333969v1), annotated and protein predicted to generate the expression hits. The libraries were normalized and compared between QL and EL at each region using DEseq2. Differential expression analysis with a padj <0.05 evidenced 233 significant transcripts. Blastp against non-redundant proteins showed annotation of proteins that were involved in mitochondrial function, ATP energy obtention, carbohydrate degradation, and ribosomal function. The GO terms were associated with protein transcription and translation, processes associated with nitrogen metabolism, and cellular biosynthesis. This approach reveals a new group of transcripts that are expressed in the QL and EL stages from different ecological regions of Colombia.