Análisis del ensamblaje de novo de transcriptoma del intestino de larvas y teleoginas rhipcephalus sanguineus lato sensu provenientes de diferentes regiones de la república de Colombia como un abordaje para identificar posibles candidatos vacunales

Abstract

El abordaje del transcriptoma se presenta como una herramienta importante que permite identificar en el ARNm la expresión proteica, para de esa forma identificar transcriptos involucrados en procesos metabólicos de organismos complejos. Este abordaje poco explorado en garrapatas Ixodidae, puede contribuir para identificar transcriptos vinculados a proteínas funcionales que puedan actuar como posibles dianas vacunales. Por consiguiente, el presente proyecto planteó realizar el estudio del transcriptoma total de las garrapatas Rhipicephalus sanguineus lato sensu provenientes de diferentes regiones de Colombia. Para este propósito se realizó el montaje de Colonias de las garrapatas colectadas que provenían de diferentes lugares de Colombia. Una vez se establecieron las colonias, se realizó el estudio filogénico a partir del DNA con la Universidad del Rosario y se extrajo el ARNm de las distintas colonias, el cual se cuantifico mediante Qubit y se analizó integralmente por el equipo de LabChip reflejando idoneidad para la secuenciación. Así, la secuenciación del transcriptoma de los distintos estadios se realizó empleando el kit rápido de MACE-seq (GenXpro GmbH, Germany) que se fundamentó en la secuenciación del extremo 3’ del ARNm empleando la plataforma NextSeq, que permitió detectar por cada lectura un transcripto. Las secuencias crudas fueron limpiadas de regiones mímicas y ensambladores de PCR. Así las lecturas resultantes fueron recortadas a partir de la región de poli adenina y se descartaron las lecturas de baja calidad. Las lecturas limpias fueron alineadas con el genoma funcional de la garrapata R. sanguineus (ASM1333969v1). Para esto, se realizó la anotación funcional del genoma a partir de regiones codificantes conocidas, que reposaban en el clúster de bioinformática del Bioinformatica Institute vinculado al Center for Tropical & Emerging Global Diseases de la University of Georgia- USA. Una vez realizada la anotación funcional del mismo, los perfiles de expresión de transcriptoma se alinearon al genoma empleando HISAT2, generando los hits de expresión por cada librería, los transcriptos se alinearon al genoma en un rango del 40%, posteriormente se normalizaron los transcriptos empleando DEssq2, se identificaron transcriptos sobre regulados de las distintas regiones al nivel de probabilidad de p ˂ 0.01, las secuencias de los transcriptos sobre regulados que se expresaron diferencialmente se predijeron a proteínas usando Genemark-ET. Las secuencias de proteínas se anotaron contra proteínas no redundantes empleando Blastp de OmicsBox las cuales permitieron identificar la expresión de proteínas únicas. Con las proteínas anotadas se anotaron los términos GO los cuales se analizaron de forma diferencial empleando el paquete TopGO que permitieron identificar los términos diferencialmente anotados al nivel de probabilidad del p ˂ 0.05. Así se concluye que el estudio del transcriptoma permitió identificar transcriptos importantes con funciones metabólicas en los distintos estadios de las garrapatas.